РОЛЬ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ И ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В РАЗВИТИИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ

УДК 612.216-112

© Коллектив авторов, 2008

Поступила 31.04.08 г.

Л.М. КАРЗАКОВА, Н.Д. УХТЕРОВА,

Л.В. БОРИСОВА, Е.П. СУНГОРКИНА,

О.М. МУЧУКОВА, Т.М. СУНГОРКИНА

РОЛЬ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ И ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

В РАЗВИТИИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ

Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова,

Республиканская клиническая больница, Чебоксары

Определены показатели врожденного и приобретенного иммунитета, а также HLA -профиль у больных ХОБЛ в чувашской популяции. Установлено, что у больных ХОБЛ активизирован гуморальный механизм, угнетен клеточный тип антигензависимого (приобретенного) иммунитета и нарушена фагоцитарная активность лейкоцитов. В чувашской популяции маркерами предрасположенности к ХОБЛ явились HLA -аллели DRB 1*11 и DQB 1*301, маркерами резистентности - аллели DRB 1*01, DQ А1*0101, DQ В1*0501.

It was defined the indicators the inborn and acquired immunity and also HLA-profile in the patients with COLD in the Chuvash population. Furthermore in patients with COLD humoral mechanism is activated, the cellular type of antigendependent (acquired) immunity is suppressed and phagocytal leukocyte activity is out of order. In the Chuvash population the susceptibility markers for COLD are HLA-allele DRB1*11 и DQB1*301, resistance markers are - allele и DRB1*01, DQ А 1*0101, DQ В 1*0501.

Введение. Ежедневно в мире, по данным ВОЗ, от хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) умирает примерно 2,2 млн человек. Главные факторы риска развития ХОБЛ - курение, загрязнение воздуха промышленными и бытовыми полютантами и неблагоприятная экология жилища. Известно, что под влиянием длительного воздействия факторов риска формируется хроническое воспаление, являющееся ключевым механизмом патогенеза ХОБЛ. В поддержании хронического воспаления при ХОБЛ значительную роль играют микроорганизмы, колонизация дыхательных путей которыми поддерживается несостоятельностью иммунологических механизмов защиты макроорганизма. Обращает на себя внимание тот факт, что не все курящие, равно как и не все работники промышленных производств, подвергающиеся вредному воздействию промышленно-производственных полютантов, заболевают ХОБЛ. Видимо, действие факторов внешней среды реализуется в развитии ХОБЛ лишь при наличии определенной генетической предрасположенности [1, 9]. Из приведенных фактов следует, что ХОБЛ - полигенное заболевание, развитие которого обусловливается неблагоприятными условиями внешней среды, а также иммунологическими и генетическими факторами предрасположенности к заболеванию. Ранее неоднократно предпринимались попытки выяснения генетических и иммунных ассоциаций ХОБЛ [1, 7, 9, 10], но до сих пор нет ясных представлений о характере иммунологических нарушений при этом заболевании. Полученные разными учеными данные весьма противоречивы. Из опубликованных генетических исследований следует отметить работу Д.Г. Янбаевой и соавт., установивших связь тяжести ХОБЛ с генами лимфотоксина-α и интерлейкина-1β [7]. Однако мы не встретили публикаций о связи ХОБЛ с генами системы гистосовместимости человека HLA, основной функцией которой являются генетический контроль иммунного ответа и поддержание иммунологического гомеостаза. В то же время достигнуты большие успехи в изучении HLA-ассоциаций при многих заболеваниях (анкилозирующий спондилит, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, болезнь Грейвса, инсулинозависимый сахарный диабет и др.). При этом отмечается особенность - в каждой популяции людей имеются свои HLA-маркеры одного и того же заболевания. Поэтому важно определять HLA-маркеры предрасположенности и резистентности к заболеванию в каждой конкретной популяции.

Цель исследования. Изучить показатели врожденного и приобретенного иммунитета, а также HLA-профиль у больных ХОБЛ в чувашской популяции.

Материалы и методы. Обследовано 52 пациента с ХОБЛ в период обострения: мужчин - 34 и женщин - 18 в возрасте 17-74 лет и 25 здоровых лиц. Сформированные группы были однородны по половому и возрастному составу. Диагностику ХОБЛ проводили в соответствии с рекомендациями GOLD [8]. Объектами исследования служили периферическая кровь (ПК), бронхоальвеолярная лаважная жидкость (БАЛЖ). Проводили иммунофенотипирование мононуклеарных клеток (МНК) ПК методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител (МКАТ) CD3, CD4, CD8, CD20, CD95 («Сорбент», Москва), определяли концентрацию сывороточных IgM, IgG, IgA по Манчини, циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) методом осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ-6000), изучали фагоцитарную активность нейтрофилов в латекс-тесте согласно стандартным методикам [6], определяли количество цитокинов - интерлейкина-1 (ИЛ-1), интерлейкина-4 (ИЛ-4), интерлейкина-8 (ИЛ-8), интерферона-гамма (ИФН-γ) («Цитокин», С.-Петербург). Функциональную активность Т-лимфоцитов изучали в реакции ФГА-индуцированной лимфопролиферации. Лимфоциты выделяли в градиенте плотности фиколла-верографина (d=1,077 г/см3). Готовили исходную суспензию, содержащую 106 клеток в 1 мл среды на основе RPMI-1640 («Sigma»), дополненную 10% пуловой сывороткой человека группы АВ (IV), 0,01М буфера HEPES(«Sigma»), 40 мкг/мл гентамицина. ФГА («Difco») использовали в конечной концентрации 15 мкг/мл. Инкубацию проводили в 96-луночных планшетах в течение 72 часов при 37º С. За 24 часа до окончания инкубации в культуры вводили радиоактивную метку - 2 мкКu/мл 3Н-тимидина. Пролиферативный ответ оценивали по интенсивности включения клетками 3Н-тимидина - числу импульсов в минуту (имп./мин) на сцинтилляционном счетчике Tri-carb («Packard», США) с последующим расчетом индекса стимуляции [6]. В целях изучения влияния наиболее часто используемых в терапии ХОБЛ антибактериальных препаратов в культуральную среду вводили ампициллин, эритромицин, цефтриаксон, ципрофлоксацин в максимальных терапевтических концентрациях [4].

В БАЛЖ изучали клеточный состав, фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов [12]. Исследование проводили с помощью латекс-теста с последующим вычислением фагоцитарного индекса (ФИ) и фагоцитарного числа (ФЧ). Метаболическую активность фагоцитов изучали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест).

Иммуногенетический анализ включал сравнительное изучение частот HLA-антигенов и генов I и II классов, HLA-А,В-гаплотипов. HLA-А,В-фенотип устанавливали в стандартном микролимфоцитотоксическом тесте с помощью набора типирующих анти-HLA-сывороток (АО «Гисанс», С.-Петербург). Типирование генов HLA II класса HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1 проводили методом мультипраймерной полимеразной цепной реакции, статистический анализ - с помощью прикладной программы «Statistica v.6.0» (Statsoft Inc., 1984-2003, США). Наличие HLA-ассоциаций оценивали по величине относительного риска (RR).

Результаты и обсуждение. У больных ХОБЛ в крови выявлены относительный нейтрофилез (р<0,001), относительная лимфопения (p<0,01) по сравнению с группой здоровых лиц (табл. 1). Результаты анализа популяционного состава лимфоцитов свидетельствуют об угнетении у больных ХОБЛ клеточного звена иммунитета, что соответствует данным многих авторов [2, 3]. В частности, при ХОБЛ уменьшено число зрелых Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD4+), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+). Экспрессия CD95+, рецепторов Fas-опосредованного апоптоза, в группе больных достоверно снижена.

Кроме того, в этой же группе выявлена низкая пролиферативная активность Т-лимфоцитов в ответ на стимуляцию ФГА (табл. 2). Обнаруженные у больных ХБ изменения в клеточном иммунном ответе, вероятно, обусловлены перераспределением лимфоцитов из системного кровотока в лимфоидные органы, миелотоксическим действием продуктов жизнедеятельности бактерий при гнойном воспалении и задержкой выхода предшественников лимфоцитов из костного мозга [11]. Выявлено ингибирующее влияние ампициллина (p<0,05), эритромицина (p<0,05), цефтриаксона (p<0,05), ципрофлоксацина (p<0,05) на пролиферативную активность Т-лимфоцитов у больных ХБ «in vitro» (табл.2). Это дает основание предположить, что антибактериальная терапия способствует угнетению антигенспецифического клеточного механизма иммунитета, связанного, как известно, с функцией Th1-клеток. Со стороны гуморального звена иммунитета обратило на себя внимание повышение уровня IgA, что согласуется с данными других авторов [3]. Активация гуморального звена в данном случае может быть объяснена реакцией на внедрение бактериального возбудителя. При подавлении функционирования Th1 клеток, участвующих в реализации клеточных иммунных реакций, происходила активация Th2 хелперов гуморального иммунитета, что определяло преобладающую форму иммунного ответа [5]. В сыворотке крови больных ХОБЛ, кроме того, наблюдали достоверно высокий уровень провоспалительных цитокинов: ИЛ-1 (p<0,05), ИЛ-4 (p<0,05), что также указывало на превалирование Th2 функции в формировании иммунного ответа (табл. 3). Фагоцитарный индекс нейтрофилов у больных ХОБЛ оказался достоверно снижен (р<0,001). Концентрации IgM, IgG и ЦИК в исследованных группах существенно не различались (см. табл.1).

Таблица 1

Показатели иммунного статуса у больных ХОБЛ и здоровых лиц

Показатель Здоровые, n=25 ХОБЛ, n=60
Возраст 40,4±5,0 46,4±17,9
Лейкоциты, х106/л 5961,2±1273,9 6257,4±2205,2
Нейтрофилы, % 59,9±7,3 66,3±7,8***
Нейтрофилы, х106/л 3572,6±59,4 4240,0±1824,4
Лимфоциты, % 35,0±6,6 29,6±6,6**
Лимфоциты, х106/л 2088,8±604,4 1794,0±637,7
CD3+, % 59,6±5,8 47,3±10,2***
CD3+, х106/л 1247,9±374,6 862,4±354,1***
CD4+, % 36,2±9,8 28,6±8,3***
CD4+, х106/л 778,2±253,2 519,9±249,0***
CD8+, % 24,2±3,5 20,4±4,1***
CD8+, х106/л 473,8±181,8 367,7±140,5**
CD4+/CD8+ 1,6±0,3 1,4±0,4
CD20+, % 15,4±5,0 17,0±11,6
CD20, х106/л 324,3±168,3 305,5±225,0
CD95+, % 19,7±3,1 15,2±6,2**
CD95+, х106/л 408,7±127,3 280,4±161,4***
IgM, г/л 1,3±0,4 1,6±0,8*
IgG, г/л 12,0±2,0 13,6±13,1
IgA, г/л 1,8±0,6 2,7±1,7**
Фагоцитарный индекс, % 64,0±5,1 50,9±10,4***
Фагоцитарное число 4,1±0,8 5,6±7,6
ЦИК, у.е. 16,9±8,6 19,0±12,1

______________

Примечания: 1. Данные представлены в виде (M±SD).

2. * - достоверность различий между показателями больных и здоровых по критерию Стьюдента:

* - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001.

Таблица 2

Показатели пролиферативной активности Т-лимфоцитов у больных ХОБЛ и здоровых лиц

Показатель Здоровые, n=20 ХОБЛ, n=31
Число импульсов в минуту в культуре МНК без ФГА 1169{637; 1509} 764{347; 1346}*
Число импульсов в минуту в культуре МНК на ФГА 24669{10750; 37334} 5311{3568; 9310}***
Индекс стимуляции на ФГА 19,5{10,6; 25,8} 7,1{4,5; 17,9}***

Индекс стимуляции на

ФГА+ампициллин

- 7,1{3,8; 15,2}#

Индекс стимуляции на

ФГА+эритромицин

- 6,1{3,1;12,6}#

Индекс стимуляции на

ФГА+цефтриаксон

- 6,6{3,5; 13,5}#

Индекс стимуляции на

ФГА+ципрофлоксацин

- 5,4{2,8; 9,3}#

______________

Примечания: 1. Данные представлены в виде Me{P25%;P75%}, где Me - медиана, P25% - нижний квартиль; P75% - верхний квартиль.

2. Достоверность различий между показателями больных и здоровых по критерию Манна-Уитни: * - p<0,05, *** - p<0,001.

3. Достоверность различий пока индекса стимуляции на ФГА по критерию Манна-Уитни: # - p<0,05.

Таблица 3

Содержание цитокинов в сыворотке крови у больных ХОБЛ и здоровых лиц

Показатель, пг/мл Здоровые, n=10 ХОБЛ, n=11
ИЛ-1β 120,1±63,5 176,6±242,8*
ИЛ-4 6,1±0,9 9,1±3,5*
ИЛ-8 7,0±1,1 15,2±31,9
ИФНγ 87,3±16,9 116,6±73,2

______________

Примечания: 1. Данные представлены в виде (M±SD).

2. Достоверность различий между показателями больных и здоровых по критерию Стьюдента: * - p<0,05, ** - p<0,01, *** - p<0,001.

При цитологическом исследовании БАЛЖ у больных ХОБЛ численно преобладали нейтрофилы (табл. 4). В смывах здоровых лиц в большом количестве обнаруживались альвеолярные макрофаги, тогда как у больных их количество было в 4,2 раза меньше (р<0,001) показателей здоровых. Число лимфоцитов в БАЛЖ при ХОБЛ достоверно уменьшалось (р<0,001). Изучение трех показателей активности фагоцитов (ФИ, ФЧ, число НСТ-положительных клеток) показало, что при ХОБЛ имелось значительное снижение фагоцитарной функции клеток слизистой бронхоальвеолярного дерева (табл. 5). ФИ макрофагов у больных ХОБЛ был в 1,5 раза меньше (р<0,01) аналогичного показателя здоровых; процент НСТ-положительных альвеолярных макрофагов у больных значительно меньше (р<0,001), составил лишь 35,6% показателя здоровых. ФИ, ФЧ, а также процент НСТ-положительных нейтрофилов были достоверно ниже показателей, выявленных у здоровых лиц. Таким образом, при обострении ХОБЛ обнаруживались однонаправленные изменения в сторону снижения функциональной активности нейтрофилов как в ПК, так и в слизистой бронхов. Данное состояние являлось синдромом дисфункции фагоцитоза. Большое значение в развитии этого синдрома имело угнетающее влияние гнойного воспаления, что связано с феноменом антигенспецифичной депрессии фагоцитов, то есть со способностью бактерий и продуктов их жизнедеятельности подавлять функциональную активность макрофагов и нейтрофилов [2]. Кроме того, одним из важнейших механизмов развития синдрома дисфункции фагоцитоза являлось нарушение выработки лимфоцитами лимфокинов, активирующих фагоциты, из-за количественно-функциональной недостаточности Т-системы иммунитета [3].

Таблица 4

Показатели эндоцитограммы больных ХОБЛ

Показатели Здоровые, n=25 ХОБЛ, n=37
Нейтрофилы 4,1±2,5 63,9±26,4***2
Альвеолярные макрофаги 64,6±10,2 15,5±13,7***
Лимфоциты 27,6±16,2 3,1±4,6***

___________________

Примечания: 1. Данные представлены в виде (M±SD).

2. Показатели здоровых по данным А.Л. Ракова, Д.Н. Панфилова, Б.И. Гельцер (Местный клеточный и гуморальный иммунитет у больных острым бронхитом // Военно-мед. журн.; Т.CCCXXII. 2001. С. 44-49).

3. Достоверность различий между показателями больных и здоровых по критерию Стьюдента: *** - p<0,001.

Таблица 5

Показатели функциональной активности фагоцитов в БАЛЖ больных ХОБЛ

Показатель Здоровые, n=25 ХОБЛ, n=30
ФЧ макрофагов 1,8±1,0 2,6±1,6
ФИ макрофагов 55,5±16,5 37,9±23,0**2
ФЧ нейтрофилов 0,6±0,45 2,4±1,1***
ФИ нейтрофилов 34,05±15,5 22,6±13,2**
НСТ макрофагов 50,6±16,2 18,0±14,2***
НСТ нейтрофилов - 6,3±4,9

______________

Примечания: 1. Данные представлены в виде (M±SD).

2. Показатели здоровых по данным А.Л. Ракова, Д.Н. Панфилова, Гельцер Б.И. (Местный клеточный и гуморальный иммунитет у больных острым бронхитом // Военно-мед. журн. Т.CCCXXII. 2001. С. 44-49).

3. * - достоверность различий между показателями больных и здоровых по критерию Стьюдента: ** - p<0,01, *** - p<0,001.

Таким образом, результаты нашего исследования показали, что у больных ХОБЛ активизирован гуморальный механизм, угнетен клеточный тип антигензависимого (приобретенного) иммунитета и нарушена фагоцитарная активность лейкоцитов, один из основных механизмов естественной (антигеннеспецифической) резистентности организма как на системном, так и местном уровне.

Изучение HLA-профиля чувашской популяции показало, что маркерами предрасположенности к ХОБЛ явились HLA-аллели DRB1*11 (RR = 5,94), и DQB1*301 (RR = 7,52), а маркерами резистентности - аллели DRB1*01 (RR = 0,022, 1/RR=45,5), DQА1*0101 (RR = 0,021, 1/RR=47,6), DQВ1*0501 (RR = 0,021, 1/RR=47,6). Это свидетельствовало о том, что у лиц, имевших в своем генотипе аллели DRB1*11 и DQB1*301, в связи с вычисленным показателем относительного риска риск развития ХОБЛ примерно в 6-7 раз выше, чем у лиц без этих аллелей. В то же время у лиц с аллелями DRB1*01, DQА1*0101, DQВ1*0501 в генотипе вероятность заболеть ХОБЛ в 45-47 раз меньше, чем у лиц, в генотипе которых эти аллели отсутствовали.

Обобщая полученные данные, можно предположить следующий механизм развития ХОБЛ. Неблагоприятные внешние факторы вызывают нарушение баланса клеточных и гуморальных реакций иммунного ответа, являющееся, по всей видимости, одним из звеньев патогенеза этого заболевания. При этом реализация влияния внешних факторов на иммунную систему находится под контролем генов системы HLA.

Выводы

1. У больных ХОБЛ активизируется гуморальный механизм, угнетен клеточный тип антигензависимого (приобретенного) иммунитета и нарушается фагоцитарная активность лейкоцитов.

2. Уменьшение числа альвеолярных макрофагов в слизистой бронхов, а также угнетение их функциональной активности негативно влияют на формирование местного иммунного ответа.

3. В чувашской популяции маркерами предрасположенности к ХОБЛ являются -аллели 1*11 и 1*301, маркерами резистентности - аллели 1*01, А1*0101, В1*0501.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Дидковский Н.А., Жарова М.А. Наследственные факторы при болезнях органов дыхания //Пульмонология. 2005. №4.С.53-60.
  2. Назаренко И.М. и др. Особенности фагоцитоза, иммунного и интерферонового статусов у детей раннего возраста с рецидивирующим обструктивным бронхитом // Педиатрия. 2001. №5. С. 20-23.
  3. Походзей И.В. и др. Иммунологическая реактивность больных хроническим обструктивным бронхитом // Тер. архив. 1988. №3. С. 38-42.
  4. Рациональная фармакотерапия заболеваний органов дыхания: Руководство для практикующих врачей /Под ред. А.Г. Чучалина. М.: Литтерра, 2004. 874 с.
  5. Хаитов Р.М. Физиология иммунитета // Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2000. №2. С. 3-16.
  6. Хаитов Р.М. и др. Экологическая иммунология. М.: Изд-во ВНИРО, 1995. 219 с.
  7. Янбаева Д.Г. и др. Полиморфные варианты генов провоспалительных цитокинов как маркеры предрасположенности к хронической обструктивной болезни легких // Пульмонология. 2005. №5. С.17-22.
  8. Global initiative for chronic obstructive lung disease. Global strategy for the diagnosis, management and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: NHLBI/WHO workshop report, updated 2003.
  9. Joos L. et al. Genetic risk factors for chronic obstructive pulmonary disease // Swiss. Med. Wkly. 2002. Vol. 132. P.27-37.
  10. Hutchison D.C. , Cooper D. Alpha1-antitrihsin deficiency. Genetic aspects of Alpha1-antitrihsin deficiency: phenotypes and genetic modifiers of emphysema risk // Torax. 2004. Vol. 59. P.254-264.
  11. Rieder M.J. Immunopharmacology and adverse drug reaction// J. Clin. Pharmacol. 1993.Vol. 33. P.316.
  12. Technical recommendation and guidelines for bronchoalveolar lavage// Ibid. 1989. Vol. 2. Р. 561-585.